Kemi

Spektroskopisk bestämning av ett ämnes sammansättning

Inledning:

När äldre tiders kemister skulle bestämma ett ämnets sammansättning använde de rent kemiska metoder. De gjorde en s.k. elementaranalys. Vid en sådan analys förbränns en känd mängd av ämnet i syrgas. Då bildas bl.a. koldioxid och vatten. När massan av dessa ämnen bestämts, kan man beräkna procenthalten kol och väte i ämnet. För övriga grundämnen i molekylen använder man andra metoder.

När man ska göra motsvarande analys idag använder man så gott som enbart avancerade spektroskopiska metoder, såsom röntegenfluorescens och ESCA. Förkortningen ESCA står för Elektron Spektroskopi för Chemicals Analysis.

Ska man bara bestämma halten av metall atomer kan man i många fall använda en metod som kallas atomabsorptionsspektrometri, AAS. Det är en relativt enkel analysmetod och kräver inte så komplicerad och dyr utrustning. Metoden beskrivs i gymnasieböckerna i kemi. Man kan dock bara analysera vissa metaller med AAS. Med en mer avancerad metod som kallas ICP kan man bestämma halten av praktiskt taget alla metall atomer med mycket hög noggrannhet. Till skillnad från AAS är ICP en form av emissionsspektroskopi (provet upphettas till så hög temperatur - ca 10 000 C- att atomerna sänder ut UV-strålning).

Vi ska inte här gå in närmare på dessa fysikaliska analysmetoder som kräver komplicerad och dyrbar utrustning.

Spektroskopiska metoder för struktur bestämning:

Som vi sett använder man framför allt spektroskopiska metoder när man ska bestämma molekylernas struktur. Vanligast är absorptionsspektroskopi.  Vid denna metod låter man det ämne som ska undersökas absorbera elektromagnetisk strålning, d.v.s. energi.  När ämnets atomer och molekyler tar upp fotoner går de över i ett exciterat tillstånd. Man kan då bestämma dels den s.k. absorbenten, dels den våglängd vid vilken absorption sker. Absorbansen utgör ett mått på den mängd fotoner som absorberas och våglängden anger absorberade fotonernas energi.
De exciterade partiklarna är emellertid instabila.  Efter en mycket kort tid återgår de till sina ursprungliga energitillstånd och sänder då ut, emitterar överskottsenergin som elektromagnetisk strålning. I stället för att mäta den energi som ämnet tar upp då atomerna exciteras kan man undersöka den strålning som ämnet avger då atomerna återgår till grundtillståndet. Denna form av spektroskopi kallas emissionsspektroskopi.

Vi ska se något på följande undersökningsmetoder som alla tillhör absorptionsspektrospin:

   ¤ Spektroskopi med ultraviolett strålning (UV) och synligt ljus.
   ¤ Infrarödspketroskopi (IR)
   ¤ Kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR)

Dessutom ska vi studera en undersökningsmetod som kallas (spektroskopisk) trots inte elektromagnetisk strålning absorberas, nämligen
   ¤ Mass-spektroskopi (MS).

Spektroskopi med UV-strålning och synlig ljus:

Vid spektroskopi i UV-området och det synliga området, d.v.s. i våglängdsområde 150-800 Nm, har strålningens fotoner sådan energi att de kan excitera någon eller några atomer i det undersökta ämnets molekyler. Atomer eller atomgrupper som absorberar energi i det nämnda våglängdsområdet kallas kromoforer. Sker absorptionen i det synliga området är ämnet färgat. Absorperar det bara i UV-området är det ofärgat.

 Aromatiska grupper och konjugerade dubbelbindningar t ex -C=C-C=C-C=C- är karakteristiska kromofoner med kraftig absorption vid vissa våglängder i UV-området.  Azo-grupper, -N=N-, som är bundna till besningringar är exempel på kromoforer som absorberar kraftigt i det synliga området. Därför ingår azogrupper ofta i färgämnen. Kraftig absorption vid en viss våglängd kan alltså vara indikation på att ämnets molekyler innehåller en viss atomkombination.

Infrarödspketroskopi (IR):

Om den absorberade strålningen ligger inom det mindre energirika IR-området räcker de absorberade fotonernas energi i regel inte till för att ändra atomernas elektronstruktur. Den upptagna energin används i stället till att ändra vibrations- och rotationstillstånd i molekylerna.

Vibrationsenergierna är kvantiserade. De kan alltså endast anta vissa bestämda värden. IR-strålningen i våglängdsområdet 2000-10 000 Nm har den energi som behövs för att lyfta molekyler till nivåer med högre vibrationsenergi. Det betyder att molekylerna kan absorbera IR-strålning inom detta våglängdsområde.

När man ska ange vilken IR-strålning ett visst ämne absorberar använder man i allmänhet inte strålningens våglängd (λ). , utan det s.k. våg talet = 1/(λ) där (λ) har enheten cm. Våg läget har alltså enheten cm-1. Våglängdsområdet mellan 2 000 och 10 000 Nm motsvaras av våg tals området 5 000-1 000  cm-1.
Ett IR-spektrum innehåller mer information om en molekyls struktur än UV-spektret och det är avsevärt lättare att dra slutsatser om de funktionella grupperna ur IR-spektret än ur UV-spektret.
Modern elektronik och datateknik har givetvis vidareutvecklat IR-spektroskopin. Man har bl. a konstruerat en IR-spektrometer som snabbt och på en gång registrerar absorbansen vid alla våglängder inom ett visst IR-område. Absorptionstopparnas lägen bestäms sedan automatiskt genom en matematisk metod som kallas Foureiertransform-IR, FTIR.
    Ett FTIR-instrument är mycket lämpligt som detektor till en gas kromatograf. När ett ämne kommer ut från gas kromatografens går det direkt in IR-spektrometern och ett IR-spektrum registreras på några sekunder. En dator jämför sedan ämnets spektrum med ett antal IR-spektra som finns lagrade i ett ((biblioteket)) i datorns minne.  Efter en kort stund lämnar datorn en rad upplysningar om ämnets struktur och den kan också ge förslag till vilket ämne det är fråga om.

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR):
Kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) -av Nukleär Magnetic Resonanser - grundar sig på att vissa atomkärnor ha ett s.k. magnetisk moment. Atomkärnor med udda masstal t ex 1H, 13C och 19F, har alltid magnetiskt moment. Det har också kärnor med jämnt masstal men udda atomnummer, såsom 2H1 och 10B5.
De för NMR-spektroskopi viktigaste atomkärnorna är 1H, och 13C.
Atomkärnorna kan uppfattas som partiklar som roterar kring en axel. Kärnor med magnetiskt moment alstrar därför ett magnetiskt fält som har samma riktning som rotationsaxeln, (( spinnaxeln)). Den roterande kärnan kan betraktas som en liten stavmagnet.
Om ((kärnmagneterna)) befinner sig i ett rum utan magnetfält orienterar de sig helt slumpmässigt. I ett magnetiskt fält däremot ställer kärnmagneterna in sig i två riktningar. De kärnmagneter som ställer in sig så att deras magnetfält har samma riktning som det yttre magnetfältet är normalt något fler än de som ställer in sig i motsatt riktning. Den anti parallella tillståndet har nämligen något högre energi än det parallella.
Kärnmagneter i det parallella tillståndet kan ta upp energi och slå över så att de står anti parallellt med magnetfältet. Storleken på den energi som en viss atomkärnorna då behöver ta upp beror bl. a på aktuella atomkärnans omgivning i molekylen, d.v.s. på den struktur molekylen har.

Vid NMR-spektroskopi placerar man ett prov av det ämne som ska undersökas i ett starkt magnetfält och bestrålar det med radiovågor. De atomkärnor som har magnetiskt moment, t ex 1H och 13C, absorberar då strålning av en viss frekvens. Man mäter dels vid vilken frekvens absorptionen sker, dels hur mycket energi provet tar upp. Ur dessa data kan man dra slutsatser om det undersökta ämnets molekylstruktur.
Vi har sett att UV- och IR-spektroskopi grundar sig på att molekylen växlar mellan nivåer som har olika elektronenergier respektive olika vibrations - och/eller rotationsenergier. Energinivåerna har värden som från början är givna och konstanta.
I NMR-spektroskopi, studerar man också partiklar som går från en energinivå till en annan. Men dessa energinivåer existerar inte förrän partiklarna kommer in i ett magnetfält. En nivå har inte heller något bestämt energivärde utan detta är proportionellt mot styrkan av det magnetfält där partiklarna befinner sig- ju starkare magnetfältet är. Desto högre blir nivåns energi. Detta betyder också att energiskillnaden mellan partiklar med anti parallellt och parallellt spin ökar med magnetfältet styrka.

1H-NMR- Spektroskopi:
Som vi sett bygger NMR-spektroskopi -oftast säger man endast NMR-på at elektromagnetisk strålning absorberas.
För fria protoner som befinner sig i ett magnetfält med styrkan 1,41 T (tesla)- ett vanligt värde på magnetfältets styrka i enkla NMR-instrument- uppgår energi differensen, ΔE, mellan det anti parallella och det parallella tillståndet till 0,024 J/mol. Denna energi motsvarar energin hos en elektromagnetisk strålning med frekvensen 60 MHz, d.v.s. en strålning i radiofrekvensområdet. Vi kan kontrollera detta med formellt ΔE = h. NA. v. där h betyder Plancks konstant, NA Avogadros konstant och v strålningens frekvens:
                                                                                                  
V= ΔE/ h. NA =0,024/6,626. 10-34. 6,023. 1023 Hz = 60 106 Hz
Om man sänder elektromagnetisk strålning genom ett ämne som innehåller protoner och befinner sig i ett magnetfält med styrkan 1,41T, skulle man följaktligen vänta sig att protonerna absorberade strålning med frekvensen 60 MHz. Då har ju strålningen den energi, 0,024 J/mol, som krävs för att ((vända)) protoner med parallellt spinn till anti parallellt spinn.
Det visar sig emellertid att absorption -man säger oftast resonans- inträder vid något lägre frekvens än det beräknande värdet. Det beror på att protonerna alltid påverkas av de elektroner som finns i omgivningen intill dem. En del av protonerna har många elektroner intill sig, andra protoner har få elektroner. Därför kommer protoner som finns på olika ställen i molekylen att absorbera strålning med något olika frekvenser. Det är på detta förhållande som NMR-spektroskopin bygger.
De elektroner som är nära proton avskärmar protonen från det yttre magnetfältet. Det medför att magnetfältet har något lägre styrka intill själva protonen. Ju högre elektrontätheten är vid protonen, desto svagare är magnetfältet intill protonen och desto lägre blir resonansfrekvensen.

När man tar upp ett NMR-spektrum för ett ämne sänder man alltså elektromagnetisk strålning genom en lösning av ämnet. Strålningens frekvens får öka successivt från något under 60 MHz till något över denna frekvens. då uppkommer resonans vid en eller flera frekvenser, beroende på antalet ((olika)) protoner i molekylen. Resonanserna registreras av en detektor som ritar upp en kurva. Denna visar dels den frekvens då resonans uppstår, dels energimängd som absorberas.

13C -NMR-spektroskopi:
Naturligt kol består till ca 1 % av isotopen 13C. Som vi sett har atomkärnan hos 13C ett magnetiskt moment liksom protonen. därför är det möjligt att få 13C -NMR-spektra av organiska föreningar. Det är emellertid mycket svårare att ta upp ett sådant spektrum än ett 1H -NMR-Spektrum. Det beror dels på den låga halten av13C -isotopen, dels på att 13C -kärnan har ett mindre magnetiskt moment än protonen.
Det dröjde därför länge innan man i praktiken kunde ta upp och analysera 13C -NMR-spektra. Tack vare elektronikens och datateknikens starka utveckling har man nu kunnat konstruera så avancerade NMR-spektrometrar att man t o m rutinmässigt kan ta upp 13C -NMR-spektra. Dessa är mer användbara än 1H -NMR-Spektra när man ska bestämma komplicerade molekylers struktur, eftersom det ju är kolatomerna som bygger upp molekylens skelett.
Av de olika spektroskopiska metoder som kemisterna nu har till sitt förfogande ger NMR den mest detaljer Ica och bästa informationen om en molekyls struktur.
Med moderna instrument kan man få ett bra spektrum även med så små substansmängder som någon bråkdel av ett milligram.

 Flerdimensionell NMR:
NMR-tekniken har utvecklats mycket kraftigt under de senaste decennierna. Användning av supraledande material har gett så starka och stabila magnetfält att man fått (( högupplösande)) NMR. Dessutom har man utvecklat en ny NMR-teknik där man samtidigt skickar in flera sekvenser av olika radiosignaler i provet, t ex signaler som tas upp av dels 1H-kärnor, dels av 13C-kärnor. Svarssignalerna från provet går in i en kraftfull dator som bearbetar signalerna och presenterar resultat i form av ett 2-dimensionellt spektrum. Där man kan se dels vilka kol-och vätekärnor som hör ihop, dels vilka kolvätegrupper som är bundna till varandra eller så nära att de påverkar varandra. Därigenom kan man få en uppfattning om prov molekylernas tredimensionella struktur.

NMR Inom Medicinen:
Under de senaste decennierna har NMR kommit till användning inom sjukvården som ett komplement röntgen.  Patienten ligger på ett rörligt bord som förs in i den spole som alstrar det starka magnetfältet. Den radiofrekventa strålningen sänds in i kroppen och absorbenten mäts. De informationer man då får behandlas av ett mycket avancerat dataprogram och resultat presenteras på en bildskärm. Med denna metod kan man upptäcka även så felaktigheter hos olika vävnader. Man kan t ex se tumörer redan i ett tidigt utvecklingsskede.

Fördelen med NMR i förhållande till röntgen är dels att patienten inte utsätts för någon skadlig joniserande strålning, dels att NMR ger en högre upplösning, d.v.s. man kan se fler smådetaljer än med röntgen. Metoden kallas ofta magnetröntgen.

Mass-spektroskopi (MS):
Mas spektroskopi brukar räknas till de spektroskopiska metoderna trots att det undersökta ämnets molekyler inte påverkas av någon elektromagnetisk strålning. I stället bombarderas molekylerna med elektroner som har medelhög energi. Då går molekylerna sönder. Man bestämmer dels massan för de brottstycken, fragment, som bildas, dels den relativa mängden av de olika fragmenten.

 
En figur som visar principen för en masspektrometer där jonstrålen böjs i ett magnetiskt fält.

Figuren ovan visar principen för en masspektrometer.  De molekyler som man vill studera förs in i en jonisationskammare. Där får de kollidera med en ström av elektroner. Då kan flera reaktioner ske. Den dominerande reaktionen är:

M + e- – – – – – > M+ + 2e-

De laddade molekylerna är instabila och de flesta av dem faller snabbt sönder i olika fragment. Fragmenteringen ger både laddade och oladdade partiklar. Det är de positiva fragmenten som man sedan studerar.
De positiva jonerna kommer in i ett elektriskt fält med hög spaning, i allmänhet 3 000- 4 000 V. De accelereras då till hög hastighet mot katoden. Jonerna får passera genom ett hål i katoden och därefter ett antal spalter. De joner som kommer ut genom den sista spalten bildar en smal stråle. Denna leds in i ett magnetiskt fält som är vinkelrätt mot partiklarnas rörelseriktning. Partiklarna går därför in i cirkelformade banor där radierna bl. a beror av partiklarnas massa.  Alla partiklar med samma massa hamnar i samma bana.
Vid ett visst värde på magnetfältets styrka går partiklar med en bestämd massa in i en detektor där de registreras. Genom att kontinuerligt öka magnetfältets styrka får man partiklar med allt större massa att gå in i detektorn. Data om magnetfältets styrka och antalet partiklar som når detektorn ställs samman till ett masspektrum.
Ur masspektret kan man utläsa massan för olika fragment som bildats och deras relativa antal. Massan för det tyngsta fragment -det som bildades vid den primära jonisationsreaktionen, M + e- – – – – – > M+ + 2e- - är i det närmaste lika med ämnets molekylmassa. Molekylen har ju bara förlorat en elektron.

 Ett masspektrum kan användas på två sätt:
¤ Det kan fungera som ((fingeravtryck)). Man kan nämligen identifiera en okänd substans genom att jämföra dess masspektrum med kända ämnens masspektra.
¤ Genom att studera ett okänt ämnes masspektrum kan man få en hel del information om ämnets struktur. den laddade molekyljonen M+ faller nämligen inte sönder godtyckligt. Vissa bindningar är svagare än andra och bryts därför lättare. En avspjälkad atomgrupp kan relativt lätt identifieras genom sin massa.

Moderna gas kromatografer har ofta en masspektrometer som detektor. Utrustningen betecknas då GC-MS. Man har också utvecklat metoder där masspektrometern används för att identifiera hög molekylära och instabila ämnen som separeras genom vätskekromatografi, s.k. LC-MS-teknik.

Den s.k. upplösningen för masspektrometer anger hur små massdifferenser apparaten kan registrera. En vanlig masspektrometer brukar ha en upplösning som anges med 1: 10 000. Det betyder att den kan skilja på partiklar vilkas massor har en differens på en tiondels promille. Avancerade masspektrometrar har en väsentligt högre upplösning, i storleksordningen 1:105 eller t o m 1: 106. Apparater som har så hög upplösning kan bestämma molekyljonernas massa med så stor noggrannhet att man kan sluta sig till formeln för ett molekylfragmnet genom att räkna på atommassorna. Följande exempel visar detta.
     Massan för ett molekylfragmnet har bestämts till 28,02 u. Tänkbara fragment med en massa på ca 28 u är:
CO+ Med massan 27,9949 u,
N2+ Med massan 28,001 u.
C2H4+ Med massan 28,0312 u 
CH2N+ Med massan 28,0187 u
Eftersom den experimentellt bestämda massan var 28,02 måste partiklarna ha formeln CH2N+.

Mas spektroskopi För Kvantitativ Analys:
GC-MS-apparater kan också användas för kvantitativ bestämning av organiska ämnen som förekommer i mycket låga halter i biologiskt material.
I en GC-MS-apparat kan man få ett masspektrum för varje topp i det kromatograf som gas kromatografen ger. Alla uppgifter lagras i instruments dator för senare analys. Man kan t e x ge datorn uppdrag att specialstudera det masspektrum en viss topp i kromatogrammet gett. När ämnet identifierats kan man bestämma dess halt i provet. Vid haltbestämningen jämför man intensiteten för några karakteristiska fragment i toppens spektrum med intensiteten för samma fragment i det masspektrum en standardlösning av ämnet ger.

Den beskrivna metoden kallas massfragmentografi eller Multipler Ion Detektion förkortat MID. Man kan uppnå så hög känslighet att det går att påvisa mindre än ett picogram av ett ämne-1 picogram = 1. 10-12 g. Metoden har fått stor användning bl. a miljövård, medicin och kriminalteknik. De används t ex för att spåra och bestämma dopingmedel.

>